穩(wěn)定細胞系構(gòu)建

銘研具有全面的穩(wěn)定細胞系開發(fā)能力，從您提供的基因序列開始，經(jīng)過基因構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、cell pool篩選，直至篩選到穩(wěn)定高表達的單克隆細胞株。高表達穩(wěn)定細胞系的篩選需要通過多水平的分析和考量，我們會從細胞水平、蛋白表達水平和基因水平進行評價分析，幫您篩選出最優(yōu)的單克隆。我們的高表達穩(wěn)定系構(gòu)建，產(chǎn)量可達克級每升。

服務(wù)內(nèi)容

• 交付內(nèi)容：高表達單克隆細胞株（1×10⁷cells/ml,1ml）或 cell pool（1×10⁷cells/ml,1ml）；克隆載體；質(zhì)檢報告；實驗流程報告；
• 周期：cell pool，8周；單克隆細胞株，12周

穩(wěn)定細胞系篩選流程

1. 細胞準備

提前兩周準備CHO細胞，保證細胞處于高活力和良好的狀態(tài)

2. 質(zhì)粒構(gòu)建

您提供序列，我們進行密碼子優(yōu)化，基因合成，構(gòu)建質(zhì)粒。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前，我們會先瞬時轉(zhuǎn)染表達評估。

3. 轉(zhuǎn)染

電轉(zhuǎn)，提前準備細胞，質(zhì)粒，和確定轉(zhuǎn)染條件。
電穿孔轉(zhuǎn)染原理：通過電場作用，在細胞膜上暫時形成小孔或開口，把大分子如DNA等導(dǎo)入細胞并最終進入細胞核中。在電擊過程中，細胞膜上出現(xiàn)穿孔，質(zhì)粒在電泳力的作用下與細胞膜接觸，并與細胞膜上電穿孔區(qū)域形成一種可轉(zhuǎn)移的復(fù)合物。再次電擊后，質(zhì)粒脫離復(fù)合物進入細胞質(zhì)內(nèi)，開始瞬轉(zhuǎn)，同時小部分質(zhì)粒進入核內(nèi)與染色體整合，開始穩(wěn)轉(zhuǎn)。DNA進入細胞，細胞膜上的小孔可自動重新閉合。

4. Cell pool篩選

轉(zhuǎn)染48小時之后，使用篩選培養(yǎng)基進行cell pool的篩選。培養(yǎng)，并挑選高表達的cell pool，放大培養(yǎng)，凍存高表達的cell pool。

5. 加壓篩選單克隆

挑選最高表達的cell pool，有限稀釋法進行單克隆篩選，鋪板密度為0.5-1 cell/well，鋪板15天后，顯微鏡觀察，標記單克隆，挑選陽性克隆，進行批培養(yǎng)和穩(wěn)定性檢測。

我們選用GS系統(tǒng)，MSX篩選，逐漸提高藥物的濃度，進行多輪次的壓力篩選，以提高基因的表達水平。

6. 表達量評估

將96孔板細胞擴增至六孔板，按4×10⁵cells 接種，一周后收集上清進行檢測，評估表達量，根據(jù)檢測結(jié)果，挑選10個最高表達的克隆進行批培養(yǎng)和穩(wěn)定性測試。

7. 批培養(yǎng)&穩(wěn)定性測試

相同密度細胞接種到搖瓶，每天取樣計數(shù)，進行ELISA檢測，確認生長和表達曲線。相同密度的細胞接種到搖瓶，每隔48小時，取樣計數(shù)，按照相同的密度繼續(xù)接種，最后進行ELISA檢測，確認細胞表達穩(wěn)定性。穩(wěn)定性測試進行50代。

GS谷氨酰胺系統(tǒng)的原理

谷氨酰胺合成酶是一種能將谷氨酸和氨合成為谷氨酰胺的酶。這種酶促反應(yīng)是動物細胞獲得谷氨酰胺的途徑。
谷氨酰胺酶在哺乳動物的生長培養(yǎng)基中扮演者非常重要的角色，一些哺乳動物系在沒有添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中無法表達足夠的谷氨酰胺來維持生存。在這些細胞中轉(zhuǎn)染GS基因可以在沒有谷氨酰胺的培養(yǎng)基中作為選擇標記來獲得增殖。其他細胞系，如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，表達足夠的GS離不開外源提供谷氨酰胺。在這種情況下，GS抑制劑，L-氨基亞砜蛋氨酸（MSX)，可抑制內(nèi)源性活性，只有轉(zhuǎn)染了額外的GS基因才可以生存。
CHO-dhfr-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，只能在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能存活。

而通過目的基因與dhfr基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由于dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（MTX）所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因必須擴增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細胞系；又由于與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細胞染色體上的同一區(qū)域，所以外源重組蛋白的序列片段也隨著dhfr基因的擴增而擴增。