脾細(xì)胞的準(zhǔn)備：

1. 將Balb/c小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精3～5min。無菌操作取出脾臟，置于盛有5mL不完全培養(yǎng)液的平皿中，洗滌3次去除脾臟表面的脂肪和結(jié)締組織。
2. 將洗好的脾臟用剪刀剪成3～5個(gè)小塊，然后將脾臟研碎，過細(xì)胞篩，收集細(xì)胞。
3. 將脾臟細(xì)胞懸液在1000r/min條件下，離心5min，棄上清。再以同樣的方法洗滌離心一次。
4. 將沉淀細(xì)胞重新懸浮于10mL不完全培養(yǎng)液中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，取108個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

注意事項(xiàng)：

• 免疫脾細(xì)胞一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，因?yàn)榇藭r(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。

骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：

1. 選好骨髓瘤細(xì)胞株，取體外培養(yǎng)對數(shù)生長期細(xì)胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細(xì)胞。
2. 取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗2次。
3. 制備細(xì)胞懸液，計(jì)活細(xì)胞數(shù)。
4. 調(diào)整細(xì)胞濃度，取10⁷細(xì)胞懸液備用。

注意事項(xiàng)：

• 常用的骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
• 骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)生產(chǎn)大量McAb。
• 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20%。細(xì)胞的最大密度不得超過106個(gè)/mL。
• 一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1:10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16～20小時(shí)。
• 一般準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對HAT的敏感性，每3～6個(gè)月應(yīng)用8～AG（8氮雜鳥嘌呤）篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。
• 保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。

細(xì)胞融合：

1. 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培養(yǎng)液。
2. 在1000r/min條件下離心8min，棄上清，用滴管輕輕吸凈殘留液體。
3. 用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細(xì)胞分散。
4. 將離心管置于37℃水浴中，吸取1mL預(yù)熱的50% PEG，緩慢滴入離心管內(nèi)，30秒內(nèi)加完，邊加邊輕輕攪拌，作用1～5min。
5. 沿管壁滴加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL和10mL，同時(shí)邊滴加邊輕輕轉(zhuǎn)動離心管。
6. 800r/min條件下離心5～10min，棄上清。
7. 將沉淀細(xì)胞輕輕混懸于含有20%的小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)液中，使細(xì)胞重懸。切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
8. 根據(jù)96/24孔板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，然后將上述細(xì)胞接種至含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板（每孔1.0-1.5mL）或96孔培養(yǎng)板（每孔0.10～0.15mL）。
9. 接種完畢后，將上述培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

• 凍存的骨髓瘤細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合融合的狀態(tài)，培養(yǎng)目標(biāo)是處于對數(shù)生長的時(shí)間盡可能長。
• 飼養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)在使用的前一天備好，這樣才能分泌足夠的細(xì)胞因子。

雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：

1. 一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。
2. 一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7～10天后，改用HT培養(yǎng)液。
3. 再維持2周后，可改用普通完全培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)：

• 經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時(shí)，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
• 在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天要更換一半培養(yǎng)液。

篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞：

1. 包被抗原：將抗原以Na2CO3-NaHCO3緩沖液包被，使抗原濃度為10～20μL，加50～100μL/孔到96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜或37℃包被2h，洗滌3次，拍干酶標(biāo)孔內(nèi)液體。同時(shí)，每板分別選取無細(xì)胞生長的兩孔為陰性對照，另選取無細(xì)胞生長的兩孔加入陽性血清作為陽性對照。檢測血清或腹水效價(jià)時(shí)，對血清或腹水做倍比稀釋，100μL/孔，以正常小鼠血清為陰性對照，37℃孵育30min，洗滌3次，拍干。
2. 封閉：每孔加200μL或加滿封閉液（PBST溶解的1%BSA），于4℃過夜或37℃封閉2h后，洗滌3次，拍干，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/li>
3. 加抗血清：無菌條件下取細(xì)胞上清，每孔加入100μL不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2h，棄去孔內(nèi)液體，拍干。
4. 加酶標(biāo)二抗：加入PBST洗滌3次，每次5min，每孔加入100μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，拍干。
5. 顯色：加入顯色劑顯色15～20min，待顏色最深時(shí)用終止液終止反應(yīng)。
6. 讀數(shù)：在酶標(biāo)儀A450上讀出各孔OD值，選擇出陽性孔。以各孔與陰性對照孔OD值的比值（P/M）大于2.1為限，作為判斷為陽性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)。

注意事項(xiàng)：

• 在收集上清時(shí)，應(yīng)在上次換液后3～4天進(jìn)行，以便抗體積累。
• 上清可不經(jīng)稀釋或1:5～1:10稀釋后再測抗體活性，用稀釋抗體進(jìn)行篩選時(shí)可以篩掉弱陽性的抗體，也可以去掉因高本底所造成的假陽性。
• 一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測，需要有相應(yīng)的對照血清。
• 融合后第一次篩選出的陽性克隆可能因陰性克隆或其他陽性克隆的過度生長而丟失，故應(yīng)盡早亞克隆。
• 第一次篩選后液可能沒篩選到陽性抗體，這可能由于分泌陽性抗體的細(xì)胞為數(shù)尚少，應(yīng)重復(fù)測定活性2～3次。
• 不同的顯色系統(tǒng)對應(yīng)不同的光吸收值。

雜交瘤細(xì)胞克隆化：

1. 制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）層。
2. 將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，并計(jì)數(shù)。
3. 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～10×103個(gè)/mL。
4. 取事先準(zhǔn)備的有飼養(yǎng)細(xì)胞生長的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，把96孔板分為4組，每組24孔，將細(xì)胞懸液按倍比稀釋法稀釋成4組細(xì)胞，即每組12.5、25、50、100個(gè)/mL，每孔加入100μL稀釋細(xì)胞，置于37℃、5%CO₂條件下進(jìn)行孵育。
5. 8～9天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測抗體活性。
6. 將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

• 初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。
• 細(xì)胞融合后，一旦經(jīng)鑒定可以產(chǎn)生目標(biāo)抗體，就應(yīng)立即進(jìn)行克隆化，確保能分離出單個(gè)細(xì)胞重新形成克隆。
• 應(yīng)在克隆前1天制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層。
• 在第7天換液，以后每2～3天換液1次。
• 陽性克隆細(xì)胞應(yīng)盡快凍存。

單克隆抗體的大量制備：

1. 先腹腔注射0.5mL降脂烷或液體石蠟于BaLb/c鼠。
2. 培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，使細(xì)胞生長至對數(shù)期，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50mL錐形離心管中，室溫下1000r/min條件下離心5min。
3. 將細(xì)胞重懸于50mL無菌的PBS或HBSS（不含F(xiàn)BS）中洗滌，1000r/min條件下離心5min，棄上清，重復(fù)2次，然后細(xì)胞重懸于5mL的PBS或HBSS中。
4. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力。
5. 用不含F(xiàn)BS的HBSS或PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10²個(gè)/mL。
6. 小鼠預(yù)處理1～2周后，對Balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射2mL細(xì)胞。接種雜交瘤細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水。
7. 一只手抓住并固定小鼠，使其腹部繃緊，另一只手用滴管將腹水吸入試管中，或用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。
8. 室溫下，1500r/min條件下離心10min，收集上清，棄沉淀，將腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成。
9. 再次收集腹水前，讓小鼠再次積累腹水（2～3天），一般一只小鼠可獲1～10mL腹水，將幾天內(nèi)收集到的腹水混合，并于56℃水浴45min進(jìn)行熱處理，如果凝塊形成，可用牙簽挑出，然后再離心。

注意事項(xiàng)：

• 注射器進(jìn)針部位為左下腹或右下腹，避免刺入小鼠上腹的重要器官及腹中線處的主要大血管。
• 腹水中含有大量的油脂、巨噬細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、腹腔內(nèi)的上皮細(xì)胞、血液中的細(xì)胞成分等雜質(zhì)，應(yīng)先離心除去這些成分。
• 油脂的密度比較小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟掉即可。