單克隆抗體制備中，成功獲得雜交細胞后，除對陽性孔進行克隆化、擴大培養外，也要及時凍存陽性孔的雜交瘤細胞，以免細胞傳代培養過程中發生突變、污染或出現細胞分泌抗體能力喪失等不良后果。
雜交瘤細胞的凍存實驗步驟
- 將凍存液保存于4℃冰箱備用，凍存管高壓滅菌備用。
- 選擇生長旺盛、飽滿透明的雜交瘤細胞，用無菌滴管吹下，2000r/min離心5min，棄去上清液。
- 將細胞沉淀物懸于預冷的細胞凍存液中，制成2～6×106個/mL細胞懸液。并分裝于細胞凍存管，每只1mL。
- 凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時，一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中；或細胞管降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中；也可以用細胞凍存裝置進行凍存。
雜交瘤細胞的復蘇實驗步驟
- 將水浴鍋預熱37℃，細胞培養液提前預熱，取5～10mL于15mL離心管中。
- 從液態氮中取出冷凍管，立即投入37℃水浴鍋中，輕輕搖動，在1～1.5min內使凍存的細胞解凍。
- 取出后，用75%乙醇消毒管外壁，放入超凈臺，將細胞轉移到含5～10ml不完全培養液的15ml離心管中， 800～1000r/min離心5min。
- 棄上清，加入細胞培養液，移入事先準備好的含有飼養層細胞的培養瓶中。輕輕搖動培養瓶，使細胞分散均勻，然后將培養瓶置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。
- 根據細胞生長速度，2～3天更換一次培養液，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。
實驗材料及儀器
實驗材料及儀器
實驗材料：穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
實驗儀器：無菌滴管，培養瓶等器材，冰箱、培養箱、離心機，超凈工作臺等設備。
培養液配方：
細胞凍存液：50%胎牛血清,10%二甲基亞砜,40%RPMI-1640培養基
細胞凍存液：50%胎牛血清,10%二甲基亞砜,40%RPMI-1640培養基,細胞培養液：20%胎牛血清,75%RPMI-1640培養基,1%谷氨酰胺,1%雙抗,最后用8.8%NaHCO3調培養液pH至7.2～7.4。
注意事項
- 凍存液最好預冷，操作時動作要輕且迅速。
- 凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性。
- 保證細胞培養液新鮮，采用少量多次配制，或培養基保存于-20℃冰箱。
- 細胞凍存與復蘇的原則是慢凍快復，最大程度的保證細胞復蘇的成功率。