單克隆抗體制備過程中，有兩次篩選過程，第一次是篩選出雜交瘤細胞（雜交瘤細胞的選擇性培養）；第二次是進一步篩選產生特異性抗體的雜交瘤細胞（篩選陽性克隆進行克隆化）。

第一次篩選

在B細胞與瘤細胞融合的過程中，存在未融合的B細胞、未融合的瘤細胞、“B細胞-B細胞”型融合細胞、“瘤細胞-瘤細胞”型融合細胞、“B細胞-瘤細胞”型融合細胞（雜交瘤細胞）以及“B細胞-多個瘤細胞”型融合細胞等多種類型。細胞融合后，進行雜交瘤細胞的選擇培養是第一次篩選的關鍵。普遍采用的是HAT選擇性培養基。

HAT培養基成分

H：次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）：完成次黃嘌呤核苷酸的補救途徑。

A：氨基蝶呤（Aminopterin，A）：葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑。

T：胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）：“核苷酸前體”，供細胞通過補救途徑合成DNA。

HAT培養基的篩選原理

細胞DNA合成包括主要合成和補救合成兩種途徑。其中，主要合成是由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，再進一步由核苷酸合成DNA的途徑。在此過程中，二氫葉酸還原酶作為重要的輔酶參與這一過程。

補救途徑是通過次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase，HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）將次黃嘌呤和胸腺嘧啶合成相應核苷酸，再進一步合成DNA的途徑，在此過程中HGPRT與TK兩種酶缺一不可。

融合所用的瘤細胞是經毒性培養基篩選出的HGPRT缺陷型細胞株。其過程為：用8-氮鳥嘌呤對瘤細胞進行篩選，它可以參與DNA合成的補救途徑，但是由此合成出來的DNA不能具備正常DNA的功能，因此這種細胞會死亡。存活下來的細胞都是不能進行補救途徑合成DNA的瘤細胞。這種缺陷型的瘤細胞與B細胞進行融合，融合后的細胞則既能通過主要途徑合成核苷酸，也能通過補救途徑合成核苷酸。

HAT培養基的選擇作用

• 未融合的B細胞、B細胞-B細胞”型融合細胞：不能無限增殖，5～7天死亡。
• “B細胞-多個瘤細胞”型融合細胞：不穩定，幾乎不能存活。
• 骨髓瘤細胞、“瘤細胞-瘤細胞”型融合細胞：合成DNA的主要途徑被培養基中的氨基蝶呤阻斷，又因自身缺乏HGPRT，阻斷了DNA補救合成途徑，不能在HAT培養液中增殖，5～7天死亡。
• 雜交瘤細胞：既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又能利用B細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤核苷酸并最終與T一起合成DNA，在體外長期生長繁殖。

第二次篩選

在單克隆抗體的生產過程中，由于B細胞的特異性是不同的，經HAT培養液第一次篩選出的雜交瘤細胞產生的抗體也有差異（包括特異性抗體分泌細胞、無關抗體分泌細胞與抗體非分泌細胞等）。因此必須對雜交瘤細胞進行第二次篩選，選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞，并進行克隆化——即把培養孔中的細胞從單個細胞進行培養繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達到均一性。

篩選分泌特定單克隆抗體的雜交瘤細胞的方法有直接接種法、有限稀釋法、軟瓊脂培養法。其中最常用方法是有限稀釋法。

有限稀釋法

• 制備飼養細胞層。
• 調整雜交瘤細胞濃度。
• 將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每孔細胞不超過一個，通過培養讓其增殖，然后檢測各孔上清液中的細胞分泌的抗體，上清液可與特定抗原性結合的培養孔為陽性孔。此時，陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，要繼續進行有限稀釋，一般需要重復3-4次，直至確保每孔中增殖的細胞為單克隆細胞。

注意

• 對于檢測抗體陽性的雜交瘤細胞應盡早進行克隆化，否則抗體分泌型細胞可能會被非抗體分泌型細胞所抑制，因為非抗體分泌型細胞的生長速度比抗體分泌型細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌型細胞丟失。
• 即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

詳細步驟參考 單克隆抗體制備步驟及注意事項