什么是細(xì)胞分選？

細(xì)胞分選（cell sorting）是根據(jù)細(xì)胞所具有的特性將某種特定的細(xì)胞亞群從混合的細(xì)胞樣品中分離出來(lái)的一種技術(shù)，是細(xì)胞學(xué)研究的重要課題。在需要對(duì)某種特定的細(xì)胞進(jìn)行功能分析時(shí)，如對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過(guò)ELISA分析檢測(cè)細(xì)胞分子、細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞功能等研究都以獲得高純度的目的細(xì)胞為前提。

常見(jiàn)細(xì)胞分選的方法有兩大類：一類是基于免疫識(shí)別特性的方法包括流式細(xì)胞分選和免疫磁性細(xì)胞分選；另一類是基于細(xì)胞物理性質(zhì)的密度梯度離心法，它主要是由于不同細(xì)胞群之間存在沉降系數(shù)差異，在一定的離心力作用下不同種類的細(xì)胞會(huì)以各自不同的速度沉降，在密度梯度不同的區(qū)域會(huì)形成區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分選目的，但分離得到細(xì)胞純度低且特異性差導(dǎo)致應(yīng)用較少，本文不做過(guò)多介紹。以下重點(diǎn)介紹基于免疫識(shí)別特性的兩種分選方法。

流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞分選是在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型的基礎(chǔ)上，使用充電分選技術(shù)以實(shí)現(xiàn)多種特定表型細(xì)胞的分離。具有分選參數(shù)多、群體多、純度高、靈活性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。分選后細(xì)胞可做進(jìn)一步分子生物學(xué)研究如熒光定量PCR、WB、細(xì)胞培養(yǎng)等。

分選型流式細(xì)胞儀一般由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)和分選系統(tǒng)4部分組成。分選功能是通過(guò)鞘液流形成的含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)的，在流動(dòng)室的噴嘴上裝有一個(gè)高速振蕩器，該裝置充電后以每秒幾萬(wàn)次的振動(dòng)頻率使鞘液流成為上萬(wàn)個(gè)液滴，細(xì)胞在進(jìn)入液滴之前已經(jīng)被測(cè)定，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則儀器會(huì)對(duì)此細(xì)胞形成液滴時(shí)給整個(gè)液柱充以指定的電荷（對(duì)標(biāo)有熒光素的細(xì)胞液滴帶以負(fù)電荷；未標(biāo)記熒光素的細(xì)胞液滴帶以正電荷；而不含有細(xì)胞的液滴則不被帶電荷）。這樣，當(dāng)被選定的細(xì)胞形成液滴時(shí)就帶有特定的電荷，未被選定的細(xì)胞和空白液滴不被充電，即不帶電荷。當(dāng)充以不同電荷的含細(xì)胞的鞘液流經(jīng)帶有正負(fù)幾千伏恒定電場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，就根據(jù)自身所帶的電荷性質(zhì)產(chǎn)生偏差而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進(jìn)入廢液槽中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的目的。

流式細(xì)胞分選的應(yīng)用

基于流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)基礎(chǔ)，根據(jù)顆粒特性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選而廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)以及環(huán)境檢測(cè)等各方面科學(xué)研究和工作中。例如：

• 用于分選外周血細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞的大小以及顆粒度等特征，對(duì)白細(xì)胞直接進(jìn)行分選獲取人外周血單核細(xì)胞，既避免了多次重復(fù)離心，又能分選得到純度80%-90%之間的單核細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，為深入研究單核細(xì)胞提供了良好的平臺(tái)；
• 用于分選染色體：能得到高質(zhì)量的單個(gè)染色體，且在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)純化大量染色體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了方便；此外還包括干細(xì)胞組織研究、移植和細(xì)胞治療研究以及疾病細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展研究等。

免疫磁性細(xì)胞分選

免疫磁珠細(xì)胞分選是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合的特性，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，而無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性抗體結(jié)合不具磁性，從而不在磁場(chǎng)中停留達(dá)到細(xì)胞分離的目的。

磁珠細(xì)胞分選所需設(shè)備簡(jiǎn)單，對(duì)技術(shù)人員要求不高，分選所得細(xì)胞靈敏度高、純度好且細(xì)胞活性和復(fù)蘇率較好，對(duì)于下游應(yīng)用影響較小，應(yīng)用前景較廣。

免疫磁性分選策略

免疫磁珠細(xì)胞分選依據(jù)可以分為兩類。一類是根據(jù)所標(biāo)記細(xì)胞的不同分為陽(yáng)性分選和陰性分選；另一類是根據(jù)分選方法不同分為直接分選法和間接分選法。

（1）依據(jù)標(biāo)記細(xì)胞的不同分類

• 陽(yáng)性分選：將目的細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的特異性抗體與磁珠相連后加入混合細(xì)胞懸液進(jìn)行孵育。在抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，以磁分離的方式將目的細(xì)胞分離出來(lái)
• 陰性分選：從多細(xì)胞懸液中分離去除非目的細(xì)胞最后得到目的細(xì)胞。但在靶細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所占比例比較小時(shí)，分選過(guò)程中存在的非特異性吸附會(huì)直接導(dǎo)致目的細(xì)胞的損失。
• 復(fù)合分選：是聯(lián)合兩種以上的分選策略進(jìn)行分選，例如先陰性分選去除非目的細(xì)胞，再陽(yáng)性分選分離目的細(xì)胞等。此種方法主要用于細(xì)胞亞群的分選或是分離得到高純度的稀有細(xì)胞。

（2）根據(jù)不同分選方法分類

• 直接分選法：將抗體或親和配體直接包被在磁性顆粒上，形成免疫磁性復(fù)合顆粒。將其與多細(xì)胞懸液混合孵育之后，目的細(xì)胞會(huì)特異性的結(jié)合在免疫磁珠上，在外加磁場(chǎng)的作用下，帶有磁珠的目的細(xì)胞滯留在磁場(chǎng)中，而非目的細(xì)胞則會(huì)被去除。
• 間接分選法：目的細(xì)胞首先與對(duì)應(yīng)的一抗孵育，激活細(xì)胞之后清洗去除未結(jié)合的一抗，后再加入預(yù)先包被有二抗的磁性顆粒與活化后的細(xì)胞進(jìn)行孵育，一抗與二抗之間的相互作用使得磁粒結(jié)合在目的細(xì)胞上，同樣在磁場(chǎng)作用下滯留目的細(xì)胞達(dá)到分選目的。

細(xì)胞分選方法的選擇

對(duì)于流式細(xì)胞分選與免疫磁性細(xì)胞分選，不同的分選方式各有優(yōu)勢(shì)不能互相取代。流式分選可進(jìn)行多參數(shù)分選以及不同熒光強(qiáng)度的分選，但對(duì)設(shè)備要求較高，對(duì)細(xì)胞刺激較大但分選靈活可以達(dá)到多方面的分選要求；磁珠分選操作簡(jiǎn)單，分選速度快，細(xì)胞活性好，對(duì)設(shè)備和技術(shù)員的要求較低，但只能通過(guò)一種標(biāo)記進(jìn)行分選。

如果磁珠分選能達(dá)到研究要求，一般首選磁珠分選，若磁珠分選達(dá)不到要求則再考慮用流式進(jìn)行分選。下表為兩種分選方法的比較：

比較項(xiàng)目	流式分選	磁珠分選
設(shè)備要求	分選型流式細(xì)胞儀	專用磁珠分離裝置
試劑	熒光素偶聯(lián)抗體	磁珠結(jié)合抗體
操作員要求	要求高，需專門(mén)培訓(xùn)	操作簡(jiǎn)單
對(duì)細(xì)胞刺激	刺激大	刺激小
多標(biāo)記識(shí)別細(xì)胞	可以分選	不可以
多路分選	可以分選	不可以
識(shí)別細(xì)胞大小和顆粒度	能夠識(shí)別	不可以

注意事項(xiàng)

當(dāng)有以下幾種實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，細(xì)胞分選只能采用流式細(xì)胞分選而不能采用免疫磁珠細(xì)胞分選：

• 當(dāng)需要非常高純度（95%-100%）的目標(biāo)群體時(shí)；
• 用于分離其表面上具有低密度受體的群體；
• 根據(jù)表面受體密度濃縮表達(dá)量不同的群體；
• 基于多色染色分選細(xì)胞；
• 基于內(nèi)部染色（例如DNA或胞內(nèi)抗原）分選細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：

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