抗體配對是在抗體的基礎上，對抗體進一步的開發應用。其中參與配對的抗體能夠同時結合相同的抗原。通常情況下，一個抗原分子擁有多個抗原決定簇，將抗原直接注入到動物體內，可引起免疫反應產生抗體，針對不同的抗原決定簇會產生不同的抗體。產生的抗體具有特異性與專一性，即一個抗體分子只會特異性地結合一個抗原決定簇。兩個針對不同抗原決定簇的抗體，有可能同時結合到同一個抗原分子上，像這種結合到同一抗原分子上的兩個抗體就是配對抗體。
需要注意的是，即使兩個抗體針對的是同一抗原分子上不同的抗原決定簇，也并不意味著這兩個抗體分子一定可以同時與抗原分子結合。當一個抗體與抗原結合后，有可能會導致其他結合位點（抗原決定簇）構型的改變，從而導致其他的抗體無法正常結合到抗原上。此外，由于位阻效應的存在，也可能使兩個結合位點距離較近的抗體無法同時結合在抗原上。因此，想要得到可以同時結合在抗原分子上的配對抗體，在制備出抗體后，還需要對抗體進行篩選。
HRP酶標抗體制備
實驗步驟——過碘酸鈉氧化法：
- 稱取5mgHRP酶，溶于0.5mL蒸餾水中
- 加入新配制的0.5mL（0.1mol/L）過碘酸鈉溶液，4℃靜置30min
- 加入0.5mL（0.16mol/L）乙二醇溶液，室溫避光混勻，靜置30min
- 加入含5mg抗體的水溶液1mL，混勻裝入透析袋，pH9.5碳酸鹽緩沖液透析，放4℃，過夜
- 加入0.2mL新配制的（0.5mg/mL）硼氫化鈉溶液，混勻，4℃靜置2h
- 邊攪拌邊滴加等體積飽和硫酸銨溶液，4℃靜置1h
- 3000r/min離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌2次
- 沉淀物溶于少量pH7.4（0.15mol/L）磷酸鹽緩沖液，透析過夜，去除銨離子后，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結合物
注意事項：
- 為提高標記效率，應嚴格掌握整個反應體系中的抗體含量。
- ELISA法測定酶標抗體效價。
- 碘酸鈉要新鮮配制。
配對抗體的篩選——雙抗體夾心ELISA法
取兩種效價高的單克隆抗體，一種作為捕獲抗體，另一種作為標記抗體（HRP酶標抗體），將捕獲抗體包被在固相載體上，先加入抗原，孵育后洗去未結合的抗原，使固相載體上形成抗體抗原復合物，并于液體中的其他物質分開。再加入標記抗體，孵育后洗去未結合的標記抗體，最后加入顯色液顯色。
- 如果可以顯色，說明該捕獲抗體與標記抗體為一對配對抗體。可進一步根據呈色的深淺進行定性或定量分析。
- 如果不能顯色，說明該捕獲抗體與標記抗體不是配對抗體。如果選擇的兩種單克隆抗體不能進行配對，則需重新選擇兩種單抗，重新進行試驗，直至找出可以配對的抗體。
配對抗體篩選流程：
實驗步驟：
- 稀釋：用pH9.6（0.01mol/L）碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5μg/mL
- 培養：用捕獲抗體包被酶標板后，4℃過夜
- 洗滌：用PBS/T20洗板3次，每次3min
- 封閉：用含3%小牛血清的PBS/T20封閉，37℃孵育1h，洗板
- 加抗原：加入倍比稀釋的抗原溶液，37℃孵育45min，洗板
- 加酶標抗體：加入HRP-單克隆抗體，37℃孵育30min，洗板
- 顯色：加入TMB顯色液，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應15min
- 終止：加入50μL終止液終止反應
- 測定：酶標儀上讀取各孔讀取OD450值
注意事項：
- 加樣品與酶標板時，應加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
- 注意避光顯色。
- 測定應在加終止液后15min以內及時測定。。
實驗試劑及儀器
實驗試劑：HRP酶、過碘酸鈉、乙二醇、碳酸鹽緩沖液、硼氫化鈉、硫酸銨溶液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、PBS/T20、HRP-單克隆抗體、TMB顯色液。
實驗儀器：離心機、冰箱、酶標儀。
抗體配對的應用
抗體配對常應用于雙抗體夾心ELISA實驗。能夠對目的抗原進行定性定量檢測，具有高靈敏度，高特異性及高穩定性的優點，可實現大批量穩定生產。